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IHC.或IF:哪个最适合我的学习?

免疫组织化学(IHC.)和免疫荧光(IF)是涉及使用抗体来检测显微镜载玻片组织内的特定蛋白质的分子测定

用IHC.,用彩色色原性地观察蛋白质,并用明田显微镜观察。  虽然与IF,用荧光染料可视化蛋白质并用荧光显微镜观察。  这些方法中的每种方法都可以用于福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织或卡扣冻干的组织。  IHC.和如果可用于检测组织中的单个蛋白质或抗体可以复用以检测一个载玻片上的两个或更多个蛋白质。 多路复用是观察蛋白质如何在组织内相​​互作用或一次查看几种不同的细胞群的绝佳方法。  这些方法中的每一个都具有优缺点。 

色原IHC.通常涉及使用具有血管氧基沉积物的DAB色原。  最常见的dab形式是棕色;这产生了具有脆棕色阳性染色的载玻片,用蓝色核。  最近,DAB已有额外的颜色,如紫色,红色,绿色,黄色,甚至是黑色。   替代备受备受备受备受备受备受备受备受备受备受备受备受备受备受备受备受备受备受备受级别可用于突出阳性染色与这些着色的色染色体。  IHC的最大优势之一是IHC.染色是永久性的,如果染色是不这样的。  幻灯片可以存档和浏览几年,甚至数十年,稍后,染色仍然应该相同。此外,在IHC.染色幻灯片中,组织结构和形态更加明显,使解释更容易。

复用发色性IHC.通常用于突出显示不重叠的不同细胞群。 然而,如果需要在小区内的共定位,这不是最佳选择。  以下是GFAP色原IHC.污渍的一些带有不同颜色的色染色剂的照片:

GFAP (brown) Hem counterstain_square GFAP (green) Hem counterstain_square

GFAP用传统的DAB(棕色)色原和苏木精(蓝色)占有

GFAP与绿色色素和苏木精(蓝色)占有

GFAP (purple) Green counterstain_square GFAP (red) Hem counterstain_square

GFAP用紫色色原和甲基绿色宿主

GFAP用红色色原和苏木精(蓝色)占有

如果是复用选择的染色方法,特别是当需要共定位或需要超过2种不同的抗体时。如果染色,抗体 将特定蛋白质加入载玻片中,然后用荧光染料可视化并用荧光显微镜观察。

以下是在HSRL处常用的荧光染料列表。 HSRL有一个Hamamatsu S60扫描仪,如果染色幻灯片。

  • FITC(荧光素)/ Cy2 / Alexa Fluor 488(绿色)
  • 德克萨斯红/ Alexa Fluor 594(红色)
  • Cy5 / Alexa Fluor 647(远红色)
  • Rhodamine / Cy3 / Tritc / Alexa Fluor555(绿黄色)
  • DAPI / HOECHST(蓝色)

如果染色是一种识别不同细胞群的有效方法以及表达多个标记的方法。  它在免疫肿瘤学研究中变得非常常见,其中可以在一个幻灯片上观看多种不同的细胞群。

下面是其中多重如果在脑组织上使用的图像:

GFAP488 IBA594 40xb_square GFAP488 Vimentin594 40x_square

GFAP(绿色)和IBA1(红色)与DAPI(蓝色)占有。

请注意,存在GFAP和IBA1抗体染色2种不同的细胞群,因此没有共同定位

GFAP(绿色)和Vimentin(红色)与DAPI(蓝色)占有。

注意,GFAP和Vimentin抗体均染色相同的细胞群,因此染色是共定的,细胞出现黄色

 

使用免疫荧光存在一些缺点。 

  • 荧光信号会随着时间的推移而褪色,最终会消失。 因此,重要的是用标准显微照片或整个幻灯片扫描记录结果。
  • 许多组织元素将自身流荧光(它们将荧光,如果它们已经用技术染色)。 一些常见的自发荧光元素是:胶原蛋白,弹性蛋白,脂血素,红细胞,中性粒细胞,血管,脂肪细胞。  因此,运行ISotype控件甚至尚未用任何东西染色以与测试组织进行比较的方式非常重要。
    • 可以以多种方式最小化自发荧光:
      • 使用冷冻部分而不是FFPE组织(FFPE组织中的自发荧光)
      • 消除使用绿色染料(大多数自动荧光在该频道中的元素)
      • 使用自动荧光淬火技术
      • 使用酪酰胺信号放大来增加将抑制自发荧光的实际信号
    • 光佛也可能是一个问题。 当荧光信号由于长时间曝光而荧光信号而发生时发生这种情况。  这少于Alexa Fluor染料的问题而不是传统的荧光染料。

HSRL的高度训练有素的科学家团队可以通过提供有关该IHC或标记对于您的学习最有效的输入来协助您的研究目标。我们精通GLP和非GLP IHC.方法开发,并将优化符合您研究需求的抗体。我们的内部Hamamatsu S60滑动扫描仪能够扫描BrightField和荧光。我们很乐意与您咨询组织收集和固定程序的建议,这将导致最佳染色结果。

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